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二代测序公司一:【专题】第二代测序技术漫谈
【专题】第二代测序技术漫谈
作者: holyala (站内联系TA) 发布: 2011-04-18
今天看到一个帖子讨论第二代测序，可惜回帖寥寥。在基因组学研究如火如荼的年代，就算不做测序，了解一下这项技术也是不错的。窃以为在不远的将来，个人基因组应用必将广泛开展，而第二代或第三代测序技术正是这一领域的主角。不才在这一领域也混了小两年，多少有些了解，今天特发此专题，希望能给大家带来一点有意思的东西。
--------------------------------------分割线---以下正文--------------------------------------第二代测序技术（Next-Generation Sequencing）
NGS之基础篇
2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。2006年，美国X大奖基金会（www.xprize.org）设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系统——Genome Analyzer，简称GA。这套基于DNA簇（DNA cluster）、桥式PCR（Bridge PCR）和可逆阻断（Reversible terminator）等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。2007年，Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据，因此也有1Gb Analyzer的含义，而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息称，Illumina已完成了600Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验，Tb（1000Gb）级的测试Run也将于年内进行。据不完全统计，Illumina公司已售出超过600台/套GA IIx和Hiseq2000平台，2010年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000，一举成为全球最大的基因组测序与分析中心，Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。
在Sanger测序时代，美国应用生物系统公司（ABI）一直是该行业的龙头老大，其垄断地位无人能撼，从早期的377到全自动化的3730xl，ABI的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛发展之初，ABI起步较晚，显得有些漫不经心。直到2005年454公司推出GS平台，ABI的领先地位受到威胁，这才开始发力，迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。此后SOLiD不断升级，目前已到SOLiD 5版本（SOLiD 5500xl）。SOLiD的全称是Sequencing by Oligo Ligation Detection，即寡聚物连接检测测序，其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接，发出不同的荧光信号，从而读取目标序列的碱基排列顺序。在该方法下，目标序列的所有碱基都被读取了两遍，因此SOLiD最大的优势就是它的高准确率。据悉，SOLiD 5平台的测序通量已达到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，准确率高达99.99%。并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测序，因此对于高GC含量的样本，SOLiD系统具有非常大的优势。
宣传视频：
454
没找到
Solexahttp://www.illumina.com/Media/flash_player.ilmn?dirname=systems&swfname=GA_workflow_vid&width=780&height=485&iframe
SOLiDhttp://media.invitrogen.com.edgesuite.net/ab/applications-technologies/solid/solid-5500.html
今天继续，454测序详解。
NGS之进阶篇
454的焦磷酸测序原理，简单来说就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用，将PCR反应每一个碱基（dNTP）的延伸与一次荧光信号的释放偶联起来，通过记录荧光信号的有无和强度，达到实时测定DNA序列的目的。在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。
454测序仪的整个实验步骤可大致概括为：样品处理、文库制备、emPCR、反应板准备、上机测序。样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。经过磁珠结合与DNA变性之后，只有A+目的片段+B形式的连接产物得以富集，另两种形式（AA、BB）的产物都被去除。emPCR是454测序的一个关键步骤，将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制该步骤的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。454测序的反应板称为PTP（Pico Titer Plate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。测序步骤如前所述，四种碱基在泵的控制下依次加入反应板，反应完成后再洗去，每延伸一个或若干个碱基，就会发出一次光信号，通过记录信号的有无和强度，即可测定DNA序列。
454测序准确度较高，当读长超过400bp时，其准确性仍能达到99%以上，主要的错误来自于同聚物，即相同碱基的连续延伸，如ATTTG这样一段序列，A和G的读取没有问题，但T只记录了一次光信号，仅信号强度与ATG序列的T有所不同，因此同聚物越长，可能产生的误差就越大。目前，由于454测序仪在读长上的明显优势，它在大基因组从头测序（de novo）、转录组分析、基因组结构分析等领域有着广泛的应用。
以下图片：1. 454 GS FLX测序仪外观；2. 3（4）种连接产物的磁珠纯化；3. PTP板与测序磁珠；4. 454 GS测序峰图；5. 上机准备实拍图。
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NGS之进阶篇二：Solexa
Illumina Solexa高通量测序平台可以说是目前“测序界”应用最广泛的NGS平台，它在兼容性、操作性和成本方面有着较大的优势，第一个亚洲人基因组“炎黄一号”、第一个非洲人基因组、熊猫基因组、家蚕基因组甲基化图谱等等，都是在该平台的支持下完成的。从最初的GA到GA IIx，又更新换代为现在的Hiseq2000，Solexa测序平台的通量由1Gb/run一路提升至300Gb/run，预计在年内还将实现1Tb/run的升级，测序读长也从几十bp提高到150bp。当年的人类基因组计划用了10年时间完成了一个基因组的精细图，而现在使用Hiseq2000测序仪只需10天左右的时间，即可完成至少3个人类全基因组的测序工作，NGS测序能力的飞速发展甚至超过了IT届的摩尔定律。
与454一样，Solexa测序平台所采用的也是SBS（Sequencing-by-Synthesis，边合成边测序）的方式，并且也利用光信号收集信息。有所不同的是，Solexa并没有采用间接反应（焦磷酸氧化荧光素）的形式激发光信号，而是直接在dNTP上连接荧光基团和阻断基团，通过“去阻断—延伸—激发荧光—切割荧光基团—去阻断”这样一个循环的方法来依次读取目的DNA上的碱基排列顺序。如下图所示，该原理在基础篇的Solexa宣传视频中亦有提及。由于采用了可逆阻断技术（即在dNTP上连接可剪切的阻断基团），Solexa测序的每一步只延伸一个碱基，不会出现类似于454测序的同聚物影响准确性的问题，因此其单碱基准确性较高，但随着读长的增加，荧光信号会有所衰弱，所以越“靠后”的碱基准确性会逐渐降低，这也是Solexa测序读长受限的一个主要因素。
Solexa平台的应用范围极广，几乎囊括了目前基因组学研究的所有方面，例如基因组从头测序（de novo）、重测序（re-sequencing）、基因组结构分析、转录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究等等。然而，应用该平台的核心过程是大致相同的，这也为它的兼容性提供了很大的便利。Solexa测序的实验流程主要包括：样品处理、文库制备、芯片准备及上级测序。根据实验目的和样品来源的不同，Solexa测序的样品处理也有所不同，基因组DNA需进行打断及片段选择，total RNA需富集mRNA或小RNA，mRNA也要进行片段化处理，ChIP（染色质免疫共沉淀）、甲基化及PCR产物等都有各自的处理方式，需要实验人员根据情况进行选择。以基因组DNA测序为例，在获得样本后，首先需要对DNA进行检测，保证样本的浓度和完整性符合实验要求，然后使用超声或氮气打断，将这些DNA分子片段化，这步与454的样品处理类似，但不需要收集特定范围的DNA片段即可用于下一步实验。文库制备过程可分为末端修复、3’端腺苷化、接头连接、片段选择、PCR扩增以及文库纯化六个步骤。末端修复是将片段化的DNA分子在几种酶的作用下，补齐随机打断造成的黏性末端而成为平末端。3’腺苷化目的是在DNA双链的3’端加上dATP，以便于下一步的接头连接。Solexa文库制备所用的接头（adapter）是一个一端互补，另一端开叉Y字形DNA片段，互补的部分5’端有一个T，可与3’腺苷化的DNA进行T-A连接，开叉的部分则是为了通过PCR扩增引入测序引物P5和P7的互补序列。接头连接完成后，再采用采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化获得特定大小的片段（通常为目的片段大小+120bp），如构建200bp文库，则回收320±20bp的DNA。之后再进行PCR扩增和纯化，即得到可用与上机测序的文库。此时的文库DNA由待测序列、测序接头、引物互补序列及index标签序列（如非index文库则无），如下图所示。
芯片准备与上机测序主要由机器完成，在此不做赘述，若想做进一步了解，可访问Illumina官方网站的技术支持：http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn。
同样，最后献上几张图片：1. cBot芯片制备仪与Hiseq2000测序仪；2. Solexa GAII测序芯片；3. Solexa测序光信号采集直观图；4. Solexa测序流程与原理示意图。
西瓜 (站内联系TA)
专题什么的，最给力了:D
holyala (站内联系TA)
已更新454测序内容，下午继续~~:tuzi21:
amilie030312 (站内联系TA)
我记得有一次听人讨论哪种测序方法更准确更真实，个人认为Solexa更可信吧，毕竟准备样本的时候扩增的酶还是有本质区别的。
小虾啄米 (站内联系TA)
什么事高通量技术呢
西瓜 (站内联系TA)
Originally posted by 小虾啄米 at 2011-04-20 13:31:21:
什么事高通量技术呢 没有查过确切定义，个人理解就是指一次可以检测大量样品，获得大量信息的技术。
以下来自百度知道：http://zhidao.baidu.com/question/179656262.html?push=ql
简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并从中找到有价值的信息。基因有基因芯片技术，蛋白有双向电泳技术，小分子有HPLC技术。
holyala (站内联系TA)
今天的搞定了，明天再来~~
wacke (站内联系TA)
东南大学陆老师研究小组2007年就开始了高通量测序的研究，并于去年成功研制出了国产第一台高通量测序仪。
holyala (站内联系TA)
Originally posted by amilie030312 at 2011-04-19 21:05:55:
我记得有一次听人讨论哪种测序方法更准确更真实，个人认为Solexa更可信吧，毕竟准备样本的时候扩增的酶还是有本质区别的。 呃~~这个嘛，目前来看，我认为这三种测序平台的准确性几乎不相上下。此外，对于Solexa测序而言，由于PCR过程中DNA聚合酶引入的误差（小于10的-6次方），远远低于由于测序过程本身造成的误差（约千分之一至万分之一）。而测序过程的误差主要来自于文库质量、信号衰减、试剂影响等。
holyala (站内联系TA)
Originally posted by wacke at 2011-04-20 21:16:03:
东南大学陆老师研究小组2007年就开始了高通量测序的研究，并于去年成功研制出了国产第一台高通量测序仪。 这个好像听说过，貌似是山寨+进口配件组装的。华大基因也在尝试仪器国产化，不过...据说国内的工业水平确实跟不上，很多精密部件还得靠进口。
amilie030312 (站内联系TA)
楼主加油，跟进学习中。
ybQuan (站内联系TA)
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-20 15:40:19:
没有查过确切定义，个人理解就是指一次可以检测大量样品，获得大量信息的技术。
以下来自百度知道：http://zhidao.baidu.com/question/179656262.html?push=ql
简言之就是可以通过一次实验获得 ... 就是很多样本可以同时测的吧？
如果片段很大，不用打断，从头到尾一次读取，全部测出来，有木有？
amilie030312 (站内联系TA)
好久没来看了，搬板凳等着楼主，继续学习中。
medtu (站内联系TA)
这个确实不错，偶下半生就玩这个了
holyala (站内联系TA)
最近因为种种原因，很长时间没有接触网络，小木虫也一个多月没上了~~希望以后有机会完成这个专题，SOLiD和测序常见问题的部分...希望:tuzi25:
原星87 (站内联系TA)
请问一下什么是读长呢，对于illumina 第二代测序技术中有提到paired-end sequencing，这个具体又是怎样一个过程呢，新手，完全不懂，敬请多多指教，谢谢了
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今天看到一个帖子讨论第二代测序，可惜回帖寥寥。在基因组学研究如火如荼的年代，就算不做测序，了解一下这项技术也是不错的。窃以为在不远的将来，个人基因组应用必将广泛开展，而第二代或第三代测序技术正是这一领域的主角。不才在这一领域也混了小两年，多少有些了解，今天特发此专题，希望能给大家带来一点有意思的东西。
--------------------------------------分割线---以下正文--------------------------------------第二代测序技术（Next-Generation Sequencing）
NGS之基础篇
2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。2006年，美国X大奖基金会（www.xprize.org）设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系统——Genome Analyzer，简称GA。这套基于DNA簇（DNA cluster）、桥式PCR（Bridge PCR）和可逆阻断（Reversible terminator）等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。2007年，Illumina公司以6亿美元的高价收购了Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据，因此也有1Gb Analyzer的含义，而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息称，Illumina已完成了600Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验，Tb（1000Gb）级的测试Run也将于年内进行。据不完全统计，Illumina公司已售出超过600台/套GA IIx和Hiseq2000平台，2010年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000，一举成为全球最大的基因组测序与分析中心，Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。
在Sanger测序时代，美国应用生物系统公司（ABI）一直是该行业的龙头老大，其垄断地位无人能撼，从早期的377到全自动化的3730xl，ABI的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛发展之初，ABI起步较晚，显得有些漫不经心。直到2005年454公司推出GS平台，ABI的领先地位受到威胁，这才开始发力，迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。此后SOLiD不断升级，目前已到SOLiD 5版本（SOLiD 5500xl）。SOLiD的全称是Sequencing by Oligo Ligation Detection，即寡聚物连接检测测序，其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接，发出不同的荧光信号，从而读取目标序列的碱基排列顺序。在该方法下，目标序列的所有碱基都被读取了两遍，因此SOLiD最大的优势就是它的高准确率。据悉，SOLiD 5平台的测序通量已达到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，准确率高达99.99%。并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测序，因此对于高GC含量的样本，SOLiD系统具有非常大的优势。
宣传视频：
454
没找到
Solexahttp://www.illumina.com/Media/flash_player.ilmn?dirname=systems&swfname=GA_workflow_vid&width=780&height=485&iframe
SOLiDhttp://media.invitrogen.com.edgesuite.net/ab/applications-technologies/solid/solid-5500.html
今天继续，454测序详解。
NGS之进阶篇
454的焦磷酸测序原理，简单来说就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用，将PCR反应每一个碱基（dNTP）的延伸与一次荧光信号的释放偶联起来，通过记录荧光信号的有无和强度，达到实时测定DNA序列的目的。在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。
454测序仪的整个实验步骤可大致概括为：样品处理、文库制备、emPCR、反应板准备、上机测序。样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。经过磁珠结合与DNA变性之后，只有A+目的片段+B形式的连接产物得以富集，另两种形式（AA、BB）的产物都被去除。emPCR是454测序的一个关键步骤，将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制该步骤的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。454测序的反应板称为PTP（Pico Titer Plate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。测序步骤如前所述，四种碱基在泵的控制下依次加入反应板，反应完成后再洗去，每延伸一个或若干个碱基，就会发出一次光信号，通过记录信号的有无和强度，即可测定DNA序列。
454测序准确度较高，当读长超过400bp时，其准确性仍能达到99%以上，主要的错误来自于同聚物，即相同碱基的连续延伸，如ATTTG这样一段序列，A和G的读取没有问题，但T只记录了一次光信号，仅信号强度与ATG序列的T有所不同，因此同聚物越长，可能产生的误差就越大。目前，由于454测序仪在读长上的明显优势，它在大基因组从头测序（de novo）、转录组分析、基因组结构分析等领域有着广泛的应用。
以下图片：1. 454 GS FLX测序仪外观；2. 3（4）种连接产物的磁珠纯化；3. PTP板与测序磁珠；4. 454 GS测序峰图；5. 上机准备实拍图。
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NGS之进阶篇二：Solexa
Illumina Solexa高通量测序平台可以说是目前“测序界”应用最广泛的NGS平台，它在兼容性、操作性和成本方面有着较大的优势，第一个亚洲人基因组“炎黄一号”、第一个非洲人基因组、熊猫基因组、家蚕基因组甲基化图谱等等，都是在该平台的支持下完成的。从最初的GA到GA IIx，又更新换代为现在的Hiseq2000，Solexa测序平台的通量由1Gb/run一路提升至300Gb/run，预计在年内还将实现1Tb/run的升级，测序读长也从几十bp提高到150bp。当年的人类基因组计划用了10年时间完成了一个基因组的精细图，而现在使用Hiseq2000测序仪只需10天左右的时间，即可完成至少3个人类全基因组的测序工作，NGS测序能力的飞速发展甚至超过了IT届的摩尔定律。
与454一样，Solexa测序平台所采用的也是SBS（Sequencing-by-Synthesis，边合成边测序）的方式，并且也利用光信号收集信息。有所不同的是，Solexa并没有采用间接反应（焦磷酸氧化荧光素）的形式激发光信号，而是直接在dNTP上连接荧光基团和阻断基团，通过“去阻断—延伸—激发荧光—切割荧光基团—去阻断”这样一个循环的方法来依次读取目的DNA上的碱基排列顺序。如下图所示，该原理在基础篇的Solexa宣传视频中亦有提及。由于采用了可逆阻断技术（即在dNTP上连接可剪切的阻断基团），Solexa测序的每一步只延伸一个碱基，不会出现类似于454测序的同聚物影响准确性的问题，因此其单碱基准确性较高，但随着读长的增加，荧光信号会有所衰弱，所以越“靠后”的碱基准确性会逐渐降低，这也是Solexa测序读长受限的一个主要因素。
Solexa平台的应用范围极广，几乎囊括了目前基因组学研究的所有方面，例如基因组从头测序（de novo）、重测序（re-sequencing）、基因组结构分析、转录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究等等。然而，应用该平台的核心过程是大致相同的，这也为它的兼容性提供了很大的便利。Solexa测序的实验流程主要包括：样品处理、文库制备、芯片准备及上级测序。根据实验目的和样品来源的不同，Solexa测序的样品处理也有所不同，基因组DNA需进行打断及片段选择，total RNA需富集mRNA或小RNA，mRNA也要进行片段化处理，ChIP（染色质免疫共沉淀）、甲基化及PCR产物等都有各自的处理方式，需要实验人员根据情况进行选择。以基因组DNA测序为例，在获得样本后，首先需要对DNA进行检测，保证样本的浓度和完整性符合实验要求，然后使用超声或氮气打断，将这些DNA分子片段化，这步与454的样品处理类似，但不需要收集特定范围的DNA片段即可用于下一步实验。文库制备过程可分为末端修复、3’端腺苷化、接头连接、片段选择、PCR扩增以及文库纯化六个步骤。末端修复是将片段化的DNA分子在几种酶的作用下，补齐随机打断造成的黏性末端而成为平末端。3’腺苷化目的是在DNA双链的3’端加上dATP，以便于下一步的接头连接。Solexa文库制备所用的接头（adapter）是一个一端互补，另一端开叉Y字形DNA片段，互补的部分5’端有一个T，可与3’腺苷化的DNA进行T-A连接，开叉的部分则是为了通过PCR扩增引入测序引物P5和P7的互补序列。接头连接完成后，再采用采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化获得特定大小的片段（通常为目的片段大小+120bp），如构建200bp文库，则回收320±20bp的DNA。之后再进行PCR扩增和纯化，即得到可用与上机测序的文库。此时的文库DNA由待测序列、测序接头、引物互补序列及index标签序列（如非index文库则无），如下图所示。
芯片准备与上机测序主要由机器完成，在此不做赘述，若想做进一步了解，可访问Illumina官方网站的技术支持：http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn。
同样，最后献上几张图片：1. cBot芯片制备仪与Hiseq2000测序仪；2. Solexa GAII测序芯片；3. Solexa测序光信号采集直观图；4. Solexa测序流程与原理示意图。
西瓜 (站内联系TA)
专题什么的，最给力了:D
holyala (站内联系TA)
已更新454测序内容，下午继续~~:tuzi21:
amilie030312 (站内联系TA)
我记得有一次听人讨论哪种测序方法更准确更真实，个人认为Solexa更可信吧，毕竟准备样本的时候扩增的酶还是有本质区别的。
小虾啄米 (站内联系TA)
什么事高通量技术呢
西瓜 (站内联系TA)
Originally posted by 小虾啄米 at 2011-04-20 13:31:21:
什么事高通量技术呢 没有查过确切定义，个人理解就是指一次可以检测大量样品，获得大量信息的技术。
以下来自百度知道：http://zhidao.baidu.com/question/179656262.html?push=ql
简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并从中找到有价值的信息。基因有基因芯片技术，蛋白有双向电泳技术，小分子有HPLC技术。
holyala (站内联系TA)
今天的搞定了，明天再来~~
wacke (站内联系TA)
东南大学陆老师研究小组2007年就开始了高通量测序的研究，并于去年成功研制出了国产第一台高通量测序仪。
holyala (站内联系TA)
Originally posted by amilie030312 at 2011-04-19 21:05:55:
我记得有一次听人讨论哪种测序方法更准确更真实，个人认为Solexa更可信吧，毕竟准备样本的时候扩增的酶还是有本质区别的。 呃~~这个嘛，目前来看，我认为这三种测序平台的准确性几乎不相上下。此外，对于Solexa测序而言，由于PCR过程中DNA聚合酶引入的误差（小于10的-6次方），远远低于由于测序过程本身造成的误差（约千分之一至万分之一）。而测序过程的误差主要来自于文库质量、信号衰减、试剂影响等。
holyala (站内联系TA)
Originally posted by wacke at 2011-04-20 21:16:03:
东南大学陆老师研究小组2007年就开始了高通量测序的研究，并于去年成功研制出了国产第一台高通量测序仪。 这个好像听说过，貌似是山寨+进口配件组装的。华大基因也在尝试仪器国产化，不过...据说国内的工业水平确实跟不上，很多精密部件还得靠进口。
amilie030312 (站内联系TA)
楼主加油，跟进学习中。
ybQuan (站内联系TA)
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-20 15:40:19:
没有查过确切定义，个人理解就是指一次可以检测大量样品，获得大量信息的技术。
以下来自百度知道：http://zhidao.baidu.com/question/179656262.html?push=ql
简言之就是可以通过一次实验获得 ... 就是很多样本可以同时测的吧？
如果片段很大，不用打断，从头到尾一次读取，全部测出来，有木有？
amilie030312 (站内联系TA)
好久没来看了，搬板凳等着楼主，继续学习中。
medtu (站内联系TA)
这个确实不错，偶下半生就玩这个了
holyala (站内联系TA)
最近因为种种原因，很长时间没有接触网络，小木虫也一个多月没上了~~希望以后有机会完成这个专题，SOLiD和测序常见问题的部分...希望:tuzi25:
原星87 (站内联系TA)
请问一下什么是读长呢，对于illumina 第二代测序技术中有提到paired-end sequencing，这个具体又是怎样一个过程呢，新手，完全不懂，敬请多多指教，谢谢了
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【导读】 2014年，基因检测行业在政策环境的剧烈变动中寻求出路。先是唐氏无创等检测项目被叫停以后，后曝出了血液外送香港的灰色链条。需求，是无法以政策手段来压制的，一项科技的成熟、推广也需要时间。今天很难，明天更难，后天很美好。我们来看看有哪些企业身处这个产业中吧。
??2014年，基因检测行业在政策环境的剧烈变动中寻求出路。先是唐氏无创等检测项目被叫停以后，后曝出了血液外送香港的灰色链条。需求，是无法以政策手段来压制的，一项科技的成熟、推广也需要时间。今天很难，明天更难，后天很美好。我们来看看有哪些企业身处这个产业中吧。
（以上排名不分先后）
??做这个分类时小编纠结了好久，因为有很多企业的业务面广泛，很难归入哪一个类别，有的企业虽然现在主要从事二代测序技术服务，但也是信心满满想转入临床市场，而号称能做生物信息学分析的企业又太多了，几乎所有的二代测序公司都有此项服务，故此处只选择一些有特色的企业新秀。
??就在小编完成这篇文章时，华大的国家基因库一期工程封顶，“同病相联”罕见病病患社区上线；药明康德的博士360罕见病平台也开始提供专业咨询服务；贝瑞和康与香港中文大学合作获得NIPT的专利授权；看达安基因今年的涨停板也是醉了；华因康的测序仪刚刚获得CFDA的认证……
??纵观整个2014年，基因检测产业获得了前所未有的关注度。政府、医院、资本、企业、人才、创业、媒体这些关键词伴随着产业的发展。基因检测是一项应用广阔的领域，这中间将诞生无数的商业模式和能提供各种服务的企业。
??基因技术的应用，使人类对自身生存状况的把握延伸到了胎儿阶段。配合大数据技术，罕见病、个体差异、先天禀赋与欠缺，都将从茫茫长夜中依稀露出轮廓。
??2015年，行业将继续发生裂变，转化医学网将持续观察和记录这些改变的发生。（转化医学网360zhyx.com） 赞一个(40)标签： 基因检测企业
