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【一】:染色方法总结
染色方法总结
AgNOR染色法:
1、试剂配制：
（1）AgNOR染色液：
甲液：明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml，在60℃使之完全溶解，再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。
乙液：硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml，4℃冰箱保存。
（2）AgNOR工作液
取甲液10 ml，乙液20 ml 临用前混合。
2、步骤：
（1）切片脱蜡至水
（2）双蒸水洗2次
（3）AgNOR 工作液中（25℃）浸染30分钟（暗处进行）（镜下观察）
（4）双蒸水洗3次
（5）脱水,透明,封固
3、结果：油镜观察，细胞核及胞质背景为淡黄色， AgNOR呈棕黑色颗粒状。
B
鞭毛染色法:
１．试剂配制：
甲液：丹宁酸 ５克
氯化铁（ＦｅＣｌ3） １．５克
福尔马林（１５％） ２．０毫升
氢氧化钠（ＮａＯＨ）１％ １．０毫升
乙液：硝酸银（ＡｇＮＯ3） ２克
蒸馏水 １００毫升
制备乙液时，待硝酸银溶解后，取出１０毫升备用，向余下的９０毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，先呈很浓厚的沉淀，再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中，先呈现薄雾，但轻摇则消失，继续边滴加边摇动，待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。如雾重，则银盐沉淀，不宜使用。
２．染色方法：
（１）将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上，置３７°培养１６—２０小时，备用。
（２）在载玻片的中部相隔一厘米处，用接种环各沾一滴蒸馏水，然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中，倾斜玻片使培养物流至另一水滴中，两水滴自然相通，菌体从上位自然扩散到下位水滴中，待干燥后染色。
（３）在干燥涂片上加甲液３—５分钟，用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后，加适量乙液保持３０—６０秒钟。染色时在酒精灯上稍加热，使染液出现蒸汽即可，用蒸馏水冲洗。
（４）镜检：菌体及鞭毛皆染成茶色。
３．注意事项：
（１）染液最好随用随配，存放至次日效果则差。
（２）一定要充分洗净甲液后再加乙液，否则背景较脏。
（３）防止水及培养物沾有氯化物。
（４）切忌用接种环涂抹培养物。
（５）载玻片一定要洗净。先用洗衣粉煮沸，再水洗，干后放在洗液中，浸泡２４小时，取出水洗除去残酸，沥干，存放于９５％乙醇中备用。 （６）加热时最好置金属板上，使载玻片受热均匀。 概述：大肠杆菌的标志基因Lac Z编码β-半乳糖苷酶（ß-galactosidase；ß-gal），在其催化作用下，半乳糖可从乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常稳定，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。因此β-半乳糖苷酶成为目前最常用的报告基因，以评价载体转染的效果。X-Gal
（5-bromo-4-chloro-3-indoyl-ß-D-Galactopyranoside） 是生物化学中常用的一种有机物，β-半乳糖苷酶可以将X-Gal转化为蓝色的产物，由此用它作为生色底物，来建立一种简单的目测颜色来确定原始组织β-半乳糖苷酶的活性，从而通过光学显微镜鉴别转染后组织细胞报告基因的存在与否和强弱表现。全组织（WHOLE MOUNT或EN BLOC）原位染色第一时间真实反应转染效果，组织形态维持良好，同时后续使用石蜡切片存档保存成为可能。
主要用途：
全组织β-半乳糖苷酶原位染色试剂是一种旨在以X-Gal为底物，通过组织内表达的外源性细菌β-半乳糖苷酶的催化所生成的深蓝色的沉积产物，从而在光学显微镜下观察到蓝色表达的组织细胞分布，藉此建立一种简单的目测颜色来识别报告基因阳性组织细胞的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。广泛应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。其适用于转基因后的人体和动物组织。产品即到即用，性能稳定，参数优化，着色敏感，堪称国际上同类产品最佳。
β－半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解为单糖：葡萄糖和半乳糖。
β－半乳糖苷酶的活性可以用X-gal（5-溴－4-氢－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）等显色底物加以检测，β－半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性的深蓝色沉淀。 X-gal可以做为组织染色剂，可以在所有表达β－半乳糖苷酶（lacz）的植物和动物组织上产生颜色。
应该是可以用来病毒感染组织切片染色的。
C
CAE染色步骤
1、试剂配制：
（1）A液：萘酚-AS—D氯醋酸10mg溶于N,N-二甲基甲酰胺1ml中。
（2）4％副品红液：取盐酸副品红(EM级)1g，溶于蒸馏水20ml内，再加入10m1／L的HCl 5m1，稍加温以增加溶解度，过滤、贮室温下。于使用前，取等量副品红液与新鲜的4％亚硝酸钠混合，之后用淀粉碘化物试纸测试，瞬间试纸应变为蓝色才合格，如果不变色，应加入更多的亚硝酸盐。
（3）B液：o．1mol/L的Michaelis Veronal-醋酸缓冲液(PH 7.6)30ml，加入新配制的副品红液3滴，用1moI／L HCl使PH值调至6．3。
2、染色步骤：
（1）将A.、B二液混合，过滤，加入氟化钠(17mg/10ml), 使之最后浓度为0.04mol/L.
（2）切片置于上述溶液内孵育1h(30℃)
（3）流水冲洗。
（4）苏木素复染。
（5）空气干燥后封固。
G
Grimelius硝酸银反应法（嗜银反应）:
1、试剂配制：
硝酸银液: 1%硝酸银水溶液 3毫升 蒸馏水 87毫升
0.2M醋酸缓冲液(PH5.6) 10毫升
还原液: 对苯二酚 1克 亚硫酸钠 5克 蒸馏水 100毫升
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水
（2）60℃硝酸银液内3小时
（3）用滤纸吸去周围银液,蒸馏水速洗
（4）入45℃的还原液处理1分钟
（5）蒸馏水洗
（6）5%硫代硫酸钠处理1 分钟(可不做)www.shanpow.com_高锰酸钾上色。
（7）水洗,脱水,透明,封固
3、结果：嗜银颗粒呈棕黑色。正常时嗜银颗粒存在于神经内分泌细胞，故此法主要用于神经内分泌肿瘤的诊断。
H
HID染色法1、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水
（2）放入预热的1当量盐酸中10分钟
（3）蒸馏水洗
（4）Schiff液中染10分钟
（5）自来水洗15分钟至细胞核红色（如2～5步不做，可在染好爱先蓝后染核固红2分钟）
（6）蒸馏水洗
（7）高铁二胺液 18～24 小时
（8）爱先蓝液(pH2.5)染10～20分钟
（9）蒸馏水洗
（10）脱水,透明,封固
2、结果: 硫酸化酸性粘液呈棕黑色,羧基化酸性粘液（唾酸粘液）物质蓝色。硫酸化酸性粘液可见于大肠粘膜，而小肠粘膜仅出现唾酸粘液，此法多用于确定肠
化的分型。
HP（硝酸银法）
1、试剂配制：
（1）醋酸缓冲贮备液，PH3.6
0.2N醋酸缓冲液，PH3.6 10 ml
蒸馏水 240 ml
以下各液均用此液配制
（2）1 %硝酸银液
硝酸银 1 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml
（3）2 %硝酸银液
硝酸银 0.2 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml
（4）5 %明胶液
明胶 5 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml
先把醋酸缓冲贮备液加温至40℃左右，然后倾入明胶，于37℃温箱内慢慢溶解，搅
拌。
（5）3 %对苯二酚液
对苯二酚 0.3 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml
（6）明胶对苯二酚液
3 %对苯二酚液 1 ml
5 %明胶液 15 ml
（7）显影液
明胶对苯二酚液 16 ml
2 %硝酸银液 3 ml
在操作到第4步完成前5分钟充分混合，置于56℃水浴箱中保温待用。
2、操作方法：
（1）组织脱蜡至蒸馏水
（2）醋酸缓冲贮备液洗2次
（3）入1 %硝酸银液中，56℃，1小时
（4）切片不水洗，直接放入预热的显影液中56℃，肉眼呈黄棕色为止。
（5）倾去显影液，于56℃的水中浸洗2分钟
（6）水洗
（7）脱水，透明，封固。
3、结果：幽门弯曲菌呈棕黑至黑色。
Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）
1、试剂配制：
甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml
碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至水
（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟
（3）用碱性乙醇分化液分化数秒
（4）水洗
（5）苏木素复染2分钟
（6）水洗
（7）脱水,透明,封固
3、结果：淀粉样物呈桔红色。
4、类淀粉染色的应用：
确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，常用于诊断甲状腺髓样癌和胰岛细胞瘤等。
L
六胺银染色法1、试剂配制：
六胺银液配制：
3%六次甲基四胺水溶液 5 ml
2.5%硝酸银水溶液 0.5 ml
摇晃，变清，再加2.5%四硼酸钠1.5~2 ml加蒸馏水至30~40 ml
2、步骤：
（1）切片脱蜡至水，蒸馏水洗
（2）0.5%高碘酸浸15分钟，蒸馏水洗
（3）六胺银液60℃，1-2小时，（或六胺银液80-90℃，半小时左右）蒸馏水洗（镜下基底膜呈黑色）
（4）0.2% 氯化金调色数秒
（5）丽春红淡染
（6）水速洗
（7）烘干，透明，封片。
3、结果：肾小球基底膜呈黑色，霉菌，弹力纤维及一些网状纤维也呈黑色。
M
Mallory 三色法1、步骤
（1）切片脱蜡至水
（2）0.5%酸性复红水溶液1 min
（3）蒸馏水洗
（4）入下液1-2min
苯胺蓝0.5g，桔黄G 2g，磷目酸或磷钨酸 1g，蒸馏水100ml。www.shanpow.com_高锰酸钾上色。
（5）蒸馏水洗
（6）95%乙醇分色
（7）脱水，透明，封片。
2、结果：胶原纤维蓝色， 红细胞桔黄色，核红色。
【二】:特殊染色技术
(一) 过碘酸-希夫氏染色（PAS染色）
PAS染色可以显示肾小球内的细胞增生、浸润和系膜基质等，并能很好的显示基底膜，是显示糖原和糖蛋白的基本染色。
1. 需要试剂
2. 具体染色步骤
(1) 切片常规脱蜡入水。
(2) 入1%过碘酸氧化10~15min，水洗。
(3) 入schiff氏液染10~30min，水洗。
(4) 苏木素染细胞核1~2min，水洗。
(5) 入1%盐酸乙醇分化数秒，水洗。
(6) 氨水返蓝数秒，水洗。
(7) 流水冲洗，镜下观察细胞核成蓝色，基底膜染成粉红色。
(8) 梯度乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片。
3. 染色结果
PAS阳性物质（多糖和糖原）呈红色，核呈蓝色。
4. 注意事项
（1） 组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则组织无法着色。
（2） Schiff氏液染色的时间需严格控制。时间过长标本基底
膜着色太深，时间过短标本基底膜着色淡。
（3） 入1%盐酸乙醇分化时间要短，时间长容易使标本褪色。
（4） 染色后的组织切片要将组织四周的污染物痕迹擦掉。
（二）六胺银-马松染色（PAM-Masson染色）
PAM-Masson染色能更清晰显示基底膜、免疫复合物和胶原纤维，免疫复合物和胶原纤维，免疫复合物的定位更为准确。
1. 需要试剂 ①1%过碘酸；②六胺银液；③苏木素染液；④氨水；⑤Masson液；⑥1%亮绿液。
2. 具体操作步骤
（1） 切片常规脱蜡入水。
（2） 入1%过碘酸氧化10~15min，水洗5min。
（3） 入六银胺液72℃染30~50分钟，以显微镜下见基底膜呈
黑色即可。
（4） 加2%氯化金数滴于组织，5%硫代硫酸钠洗。
（5） 苏木素染细胞核1~2min，1%盐酸乙醇分化，氨水返蓝。
（6） 入Masson液约10min，1%醋酸洗。
（7） 入1%亮绿5~8min，1%醋酸洗。
（8） 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。
3．染色结果
基底膜及系膜基质黑色，免疫复合物红色。
3. 注意事项
（1） 组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则组织无法着色。
（2） 染色时间与室温和切片厚度有关，室温低、切片厚需染
色时间长，反则需染色时间短。入六胺银液染色的时间
需严格控制。时间过长基底膜着色过深，时间过短基底
膜着色淡。
（3） 2%氯化金分化时间要短，时间长容易使银染褪色。
（4） 染色后的组织切片要将组织四周的污染物痕迹擦掉。
（三）马松染色（Masson染色）
Masson染色能显示各部位的免疫复合物，肾小球硬化和肾小管纤维化程度。
1. 需要试剂 ①苏木素染液；②氨水；③Masson液；④1%亮绿液。
2. 具体操作步骤
（1） 石蜡常规脱蜡入水。
（2） 媒染剂（10%重铬酸钾、10%三氯醋酸等量混合）染10~30min，
水洗。
（3） 苏木素染细胞核1~2min，水洗。
（4） 入1%盐酸乙醇分化数秒，水洗，氨水返蓝数秒，水洗。
（5） 入Masson液约10min，水洗，1%醋酸洗。
（6） 入2.5%磷钨酸约30s，水洗，1%醋酸洗。
（7） 入橘黄G约2min，水洗，1%醋酸洗。
（8） 入1%亮绿5~8min，1%醋酸洗。
（9） 入100%乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片。
3. 染色结果 细胞核红色，胶原纤维绿色，免疫复合物红色。
4. 注意事项
（1） 组织切片的脱蜡步骤应彻底，否则组织无法着色。
