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DEPC水篇(一):DEPC水你不知道的秘密
一、DEPC物理化学性质
DEPC即二乙基焦碳酸酯，由名可知其为一种酯类，由此可知其一定有水果的香味（易挥发），一定也可以进行水解反应生成醇和酸，具体反应过程如下：
由上述化学结构知其极不稳定，在PH=6的溶液中半衰期为20min，其容易与胺、羟基（蛋白）、咪唑基（RNA）和硫醇反应，因此其能灭活各种酶类，其对人体有害，如果不小心沾到身上，请用大量清水清洗。
二、使用方法
DEPC有这么强大的功能，那么对于我们RNA提取肯定必不可少，那么如何使用呢？
DEPC处理水制备方法：有效DEPC浓度：0.05%-0.1%，处理时间一小时以上，然后高压15min，高压后水果香味越轻越好。注意：在使用DEPC水溶液是浓度不宜过高，首先该浓度下对于处理水溶液中参与的酶已经足够，而且过高的DEPC会有残余的风险。由于DEPC为酯类，其在酸碱溶液中极不稳定，因此在制备DEPC水应该注意水的PH值，
DEPC水处理Tip头：用DEPC的水溶液（0.05%-0.1%）处理过夜，然后高压15min。
不得使用DEPC水擦拭台面和移液器，不得使用DEPC水配置Tris缓冲液
三、你不知道的秘密
由上面可知：DEPC处理水中并不含DEPC，因此其在使用过程中一定要防止污染，尽量分装使用。
有研究证明Milli-Q超纯水与DEPC处理水在用来做RNA相关的实验时效果相同。Reference：PMID8643347
文章摘要：The Milli-Q PF Plus water polishing system is equipped with high-purity ion and organic removal media and a capillary fiber ultrafiltration device. The system produces ultrapure water practically free of ribonuclease contamination. The necessity for diethyl pyrocarbonate (DEPC) treated solutions in RNA molecular biological procedures was tested by preparing RNA from a variety of tissues and tissue cultured cells using either DEPC-treated, autoclaved solutions or pure Milli-Q PF water dispensed directly from the system. Tissue sources included rabbit brain, heart, lung, liver, kidney, and bladder as well as cultured human corpus cavernosum smooth muscle cells (HCCSMC). RNA was prepared by solubilization in guanidinium isothiocyanate, phenol/chloroform extraction, and isopropanol precipitation followed by Northern blot analysis. Hybridization with fibronectin (approximately 7.6kb) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (1.2kb) revealed that water from a Milli-Q PF water system performed as well as DEPC-treated, autoclaved solutions. RNA stability at 37 degrees C was examined for various times using rabbit lung RNA in either DEPC-treated water or Milli-Q PF water. Intact RNA was detected after 6 hours in total RNA and by Northern blots hybridized with fibronectin. There was no significant difference in RNA degradation between DEPC-treated water or Milli-Q PF water. We conclude that Milli-Q PF water is an acceptable substitute to DEPC-treated water for the preparation of RNA and Northern blot analysis.
相信你看完上面的红字部分，你可以发现使用milli-q超纯水和它是一个效果吧，以后不用花钱买这个了吧，又省了一大笔。
DEPC水篇(二):提取RNA及用DEPC去除RNase的个人总结(转）
快速的操作，低温环境，少量取上清主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。分子克隆第二版343页,上关于提取RNA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;另一种方法是0.1%的depc水浸泡(37度2小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤15分钟,然后高压灭菌除去depc.我们实验室一直是用170度考4小时,且不准离人,不准过夜,可能是怕烤箱长时间高温,线路老化会发生危险吧 提取RNA所用的枪头，EP管。直接高压烘干即可。如果用0.1％DEPC处理，要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头，EP管方有效。我做的都是将枪头泡在配制好的depc中，摇振过夜，然后倒掉depc注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可120度干烤一会A.对于提取RNA来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip头的去除RNase处理,尤其是去除RNase的DEPC处理步骤B.您在处死大鼠前,先准备好干净的冻存管(用1.5ml的Ep管也可以,就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆,您的注意安全),然后将去除的骨骼肌立即用干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小,装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这里使用装标本的管子没必要用DEPC处理C.在提取RNA之前,将试剂(TRIzol)和器械(tip头,镊子,匀浆器)都准备好D.从液氮取出标本后,立即转移进入事先加入TRIzol的匀浆器内(最好置冰上操作),立即匀浆,一直到标本完全碾磨碎,这个时候TRIzol液体成浑浊状,而且匀浆器的壁上没有太多的黏附组织,然后将TRIzol转出,继续后续的步骤.1 Rnase是一种蛋白酶，能够降解RNA。2我们的手上皮肤上有很多，应该是对我们的身体起保护作用。保护不被RNA病毒感染？或者什么的。3 这个酶高效稳定。要么在DEPC水中处理n小时，要么在160度高温烘烤6小时。此酶才会失效。4 所谓DEPC，是一种叫做焦碳酸二乙酯的东西。有毒啊。所谓DEPC水，一般指两种状态，a，配制 好未消毒；b，配制好已消毒。通过高压消毒，该物质会降解，从而无毒。1 无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌4小时以上至完全溶解，高压灭菌20分钟，冷却备用。这个是DEPC水的b状态。2 如果你要用DEPC水处理Tips等等东东，那么就要用高压前的水，即DEPC水的a状态。把枪头管子等完全浸泡至少8小时，我一般都是过夜的，或者平时就泡在里面备用。RNA提取必须创造无RNase的环境，所有仪器与试剂均按照以下方法进行处理 ：研钵、研棒、药匙、玻璃器皿等需在180℃烘干4h以上； 电泳槽、胶板、梳子、用0.1 %～0.2%DEPC水处理过夜或者用洗涤灵清洗干净后用0.5%的SDS (Sodium dodecyl sulfate，抑制RNase的活性)浸泡过夜，然后用ddH2O冲洗干净，晾干备用；离心管，枪头等塑料器皿要用0.1%～0.2%DEPC水处理之后(DEPC有致癌之嫌，须小心操作)。37℃保温12h以上，然后高压灭菌，灭活DEPC ( Diethypyrocarbonate )；溶液都需用经DEPC处理过的水配置， RNA提取的所有操作应尽可能在超净工作台上进行。 我们研究所里提RNA用的枪头和EP管都是高压两遍的，没有用DEPC水处理。1、 有灭菌过的DEPC水，这一般是用来配75%乙醇用，因为乙醇若高压灭菌会挥发，所以乙醇是新开封专用的。2、 没有经高压灭菌的DEPC水，这主要是用于配你提RNA所用的其他试剂（所说的试剂是可以经高压灭菌的），总的来说，都得经过高压灭菌，目的就是要去除DEPC，以防止它以随后实验的干扰。3、 DEPC处理水：无菌蒸馏水中加入0.1%(v/v)焦碳酸二乙酯（DEPC），室温搅拌4小时以上，121 度高压灭菌20分钟，冷却备用。 凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂. 为啥在28s之后还是有影影约约的片断？和模糊的smear？这都与非变性电泳方式有关。RNA 的电泳，严格讲是要使用变性电泳的，我们平时所知道的 RNA 电泳的知识，实际上都是由变性电泳获得的。但因为非变性电泳实在是太方便了，同时，就一般检测而言，完全可以替代变性电泳，所以我们日常检测就都使用非变性电泳了。电泳时间太长了容易产生降解。最好是在120V左右。操作的时候有没有注意戴口罩和手套，注意，手套要经常换，不要太节约了。那样也会影响RNA的质量。无论你是提什么RNA只要是用异丙醇沉淀的，都得用75％的酒精洗涤一次。1 样品不要太多，抽提务必充分，室温放置5min；2 200ul氯仿 剧烈振荡20s，室温放置2－15min；3 13000g 离心 15min;4 取上层水相,一般400-450ul就足够了，千万不要贪多！***5 加入500ul异丙醇 摇匀，室温放置10min； 6 12000g 离心 10min；7 75％乙醇 1000ul 洗涤沉淀；8 7500g 离心 5min；（12000转速太高了吧，沉淀不容易溶解的）9 弃乙醇，吸干净残余的微量乙醇， 室温干燥3－5min；（时间太久沉淀不易溶解）10 适量DEPC水溶解沉淀。电泳的上样量1ug，电泳buffer用DEPC处理的水配制，电泳时间不要太久，95V，10－15min足够了。建议跑RNA电泳。先用2％琼脂糖胶，若分离效果不好，可用甲醛变性胶。在上样缓冲液中注意加入RNA酶抑制剂。注意观察带形，质量较好的RNA亮度 。28S:18S应为2:1。还要注意观察，在加样孔或刚出加样孔附近，有没有带， 若有，可能为基因组DNA污染。 OD值只有1.5，可能为基因组DNA污染。参考一下分子克隆3。上面有OD值与 污染DNA的关系。建议，酚氯仿抽提后，上清可少吸一些。提取后的RNA样品可用无RNA酶的DNA酶消化一下。注意该酶的buffer中有一种物质在OD260有吸光度，应严格按照其protocol操作，减少误差。 只要用DEPC处理过的水，打开一瓶新的无水乙醇（或者专用于RNA的，即只用处理过的枪头取过乙醇的）配就可以了。DEPC高温高压时变成CO2和水，再加上乙醇也很容易气化，可能是因为有气体产生吧，如果盖子太紧容易发生瓶子破掉的事情。（我还从来没有听说过把乙醇高温灭菌过）而且，湿热灭菌本身不足以去除RNA酶，所以我觉得有时候，灭菌可能反而引入RNA酶污染也不一定哦 75%的乙醇用于提取RNA 时最好还是现用现配，乙醇最好是新的且以后不要用于其他方面，也就是留一瓶专门用于提取RNA。DEPC一般高压灭菌30分钟就可以了！75%乙醇：灭菌后的千分之一DEPC水25ml+75ml无水乙醇.配好后装入高温烘烤的玻璃瓶中（160干烘四小时），或塑料器皿的用千分之一的DEPC泡12小时以上再灭30分钟，存放于低温冰箱4度保存!!!
DEPC水篇(三):RT-PCR实验所用器材等总结『经典』 - 二楠的日志 - 网易博客
Rt-PCR实验步骤一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大
二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）
三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。2、75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris 54g硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml？ pH8.0蒸溜水 1000ml
5×TBE （贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水——→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油
6×缓冲液，4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的Rt-PCR材料：（生工. Tel. 2236106.）Taq酶（含MgCl2 Buffer） 200u 70.00dNTP: 1支oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promegaM-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer)RNasin: 1支 110—— -20℃
DEPC 5g 110.00Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies—— 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威（1543. 994. 697. 515. 377. 231）七、引物合成1、内参照：GAPDH正义：5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′反义：5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′
β-actin正义：5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′反义：5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′
2、par-4:正义：5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′反义：5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′
3、退火温度计算2（A+T）+4（G+C）正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）
4、引物各合成5 OD，每OD一瓶分装好
5、引物稀释：加DEPC水量为（μl）= ? nmol / OD × 管上所标OD数×100是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳先将1-10μl左右PCR产物，加已点在纸上的溴酸兰，反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。
九、几个注意点：1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴？2、Rt时，先打开PCR预热30分钟。3、RNA抽提前，打开离心机预冷。
在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
电泳缓冲液、染料和凝胶加样液①电泳缓冲液1. 50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液 成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 2mol/L Tris碱 242g 1mol/L 乙酸 57.1 ml的冰乙酸（17.4 mol/L） 100 mmol/L EDTA 200ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 水 补足1L2. 5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液 成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量 445 mmol/L Tris碱 54g 445 mmol/L 硼酸盐 27.5g 硼酸 10 mmol/L EDTA 20 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0） 水 补足1L②染料1. 1％溴酚蓝（bromophenol blue）加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。2. 1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）溶解1g二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。3. 10mg/ml的溴化乙锭（ethidium bromide）小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管，于4℃贮存。③凝胶上样液（gel loading solutions）1. 6×碱性凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.3 N 氢氧化钠 300ul 10N 氢氧化钠 6 mmol/L EDTA 120ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 18％聚蔗糖（400型） 1.8g 0.15％溴甲酚绿 15mg 0.25％二甲苯青FF 25mg 水 补足到10ml2. 6×聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 1.5ml 1％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 1.5ml 1％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 15％聚蔗糖（400型） 1.5g 水补足到 10ml3. 6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.25％溴酚蓝 2.5ml 1％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 2.5ml 1％二甲苯青FF 15％聚蔗糖（400型） 1.5g 水补足到 10ml4. 6×甘油凝胶上样液（4℃贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 1.5ml 1％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 1.5ml 1％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 50％甘油 3ml 水 3.9ml5. 6×蔗糖凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.15％溴酚蓝 1.5ml 1％溴酚蓝 0.15％二甲苯青FF 1.5ml 1％二甲苯青FF 5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 40％聚蔗糖 4g 水 补足到10ml6. 10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液（室温贮存） 成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量 0.2％溴酚蓝 20mg 0.2％二甲苯青FF 20mg 200 mmol/L EDTA 4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 0.1％SDS 100ul 10％ SDS 50％甘油 5ml 水 补足到10ml[/size]
